水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測(cè)定 液相色譜法
SC/T 3021—2004
發(fā)布單位：中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部
1、范圍
    本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠殘留量的液相色譜測(cè)定方法。
    本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品可食部分中孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠殘留量的檢測(cè)。
2、規(guī)范性引用文件
    下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
    GB/T 6682  分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
3、術(shù)語(yǔ)和定義
    下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3.1
    孔雀石綠malachite green
    屬于三苯甲烷染料類(lèi)，分子式為C23H25ClN2，綠色結(jié)晶體。
    注：孔雀石綠的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)附錄A。
3.2
無(wú)色孔雀石綠  leucomalachite green
    N，N—二甲基苯胺，孔雀石綠在水生生物體中的主要代謝產(chǎn)物，分子式為C23H26N2 。
    注：無(wú)色孔雀石綠的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)附錄A。
4、原理
    以乙酸胺鹽溶液和乙腈提取樣品中的孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠后，經(jīng)過(guò)液一液萃取，固相萃取，用接有氧化柱的C18柱進(jìn)行高效液相色譜分析，外標(biāo)法定量。
5、試劑
5.1  所有試劑應(yīng)無(wú)干擾峰，應(yīng)選擇優(yōu)級(jí)純或色譜純的試劑，分析純?cè)噭?yīng)重蒸。
5.2  孔雀石綠及無(wú)色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品：孔雀石綠純度≥90％，無(wú)色孔雀石綠純度≥90％。
5.3  乙腈：色譜純。
5.4  二氯甲烷：分析純。
5.5鹽酸羥胺溶液：0.25g/mL。
5.6二甘醇：分析純。
5.7  乙酸銨溶液：0.1mol/L(pH4.5)，0.125mol/L(pH4.5)。
5.8  對(duì)甲苯磺酸溶液：0.05mol/L。
5.9  堿性氧化鋁：分析純，粒度0.071mm～0.1501nrn。
5.10  中性氧化鋁：分析純，粒度0.07mm～0.150mm。
5.11  丙基磺酸陽(yáng)離子樹(shù)脂：PRS(propylsulfonic acid)，40μm。
5.12  孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取孔雀石綠0.100 0g，用乙腈溶解，定容于100mL容量瓶中，使成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用乙腈稀釋成0.1lμg/mL的工作溶液。該溶液應(yīng)避光保存。
5.13  無(wú)色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取無(wú)色孔雀石綠0.100 0g，用乙腈溶解，定容于100mL容量瓶中，使成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用乙腈稀釋成0.1μg/mL的工作溶液。該溶液應(yīng)避光保存。
5.14二氧化鉛：分析純。
5.15  硅藻土：精制工業(yè)硅藻土。   
5.16  水：應(yīng)符合GB/T 6682的要求。
6、儀器
6.1  高效液相色譜儀：配可變波長(zhǎng)檢測(cè)器。
6.2  電子天平：感量0.0001g。
6.3  勻漿機(jī)。
6.4  離心機(jī)。
6.5  振蕩器。
6.6 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。
6.7  固相萃取柱：PRS柱，中性氧化鋁柱。
6.8 色譜柱:C18柱。
6.9  柱后氧化柱:柱內(nèi)填料:二氧化鉛:硅藻土=1∶
7、操作方法
7.1  樣品處理
7.1.1  取樣
    魚(yú)去鱗、皮，沿背脊取肌肉；蝦去頭、殼，取可食肌肉部分；蟹、甲魚(yú)等取可食部分。所取樣品切為不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小、塊后混勻。
7.1.2  稱(chēng)取樣品10g～20g(精確到0．001g)，置于勻漿杯中，向杯中依次加3mL鹽酸羥胺溶液、5mL對(duì)甲苯磺酸溶液和20mL 0.1mol/L的乙酸銨溶液，勻漿2min，轉(zhuǎn)移到250mL三角瓶中，用60mL乙腈洗滌勻漿杯，洗滌液合并到三角瓶中，加入20g堿性氧化鋁，用振蕩器振蕩5min，轉(zhuǎn)移至4支50mL離心管內(nèi)，30mL乙腈洗滌三角瓶后轉(zhuǎn)移到離心管中，4 000r/min離心15min。
7.2  分離純化
7.2.1  液一液萃取
7.2.1.1  將離心管上清液移入分液漏斗中，向離心管中加入乙腈，洗滌，離心(4 000r/min，15min)，合并上清液到分液漏斗中，并加入100mL水、50mL二氯甲烷和2mL二甘醇，劇烈振搖分液漏斗，靜置1 h。
7.2.1.2  用蒸發(fā)瓶收集下層液體后，再往分液漏斗加入50mL二氯甲烷，振搖，靜置約10min，待其分層后收集下層液體于同一蒸發(fā)瓶。將收集液在35℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(注意：開(kāi)始時(shí)溫度不要直接升到35℃，以免爆沸)至體積約2mL～3mL。
7.2.2  固相柱萃取
7.2.2.1  固相柱制備
    采用中性氧化鋁(1g)、PRS填料(0.5g)分別裝填兩只固相萃取柱，按中性氧化鋁柱在前、PRS柱在后的順序?qū)芍?lián)。
7.2.2.2  上樣
     使用前用5mL乙腈預(yù)洗兩柱，然后將7.2.1.2濃縮液體加入5mL乙腈混勻后，緩慢加入中性氧化鋁柱內(nèi)(注意：不要引起柱表面填料浮動(dòng)。)再用5mL乙腈洗滌蒸發(fā)瓶?jī)纱危瑑纱蜗礈煲壕尤胫鶅?nèi)，最后用5mL乙腈洗滌兩柱。
7.2.2.3  洗脫收集
    棄去中性氧化鋁柱，用2mL水洗PRS柱，洗脫液棄去；加入0.5mL乙腈：乙酸銨溶液(0.1mol/L，pH4.5)=1∶1，洗脫液棄去；再加人2mL乙腈：乙酸銨溶液(0.1mol/L，pH4.5)＝1∶1，收集該洗脫組分，定容到2mL，經(jīng)聚四氟乙烯膜(孔徑0.45um)過(guò)濾，待上機(jī)分析。
7.3  樣品測(cè)定
7.3.1  測(cè)定條件
7.3.1.1  色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm；柱后氧化柱:35mm×4.6mm。
7.3.1.2  流動(dòng)相：乙腈:乙酸銨溶液(0.125mol/L，pH4.5)=80∶20；流速：2mL/min。
7.3.1.3  柱溫：35℃。
7.3.1.4  進(jìn)樣量：50μL。
7.3.1.5 檢測(cè)波長(zhǎng)：588nm或618nm。
7.3.2  色譜分析
分別注入50μL濃度為0.1μg/mL的孔雀石綠溶液、無(wú)色孔雀石綠工作溶液及樣品提取溶液于液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)附錄B。
8、結(jié)果
8.1  計(jì)算
    樣品中孔雀石綠、無(wú)色孔雀石綠的含量按公式(1)計(jì)算。
X=  A×Cs×V   ……………………………………………………………(1)
   As×m×1000
式中：
    X——樣品中孔雀石綠(無(wú)色孔雀石綠)含量，單位為微克每千克(μg/kg)；
    Cs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中孔雀石綠(無(wú)色孔雀石綠)含量，單位為微克每毫升(μg/mL)；
    A ——試樣液中孔雀石綠(無(wú)色孔雀石綠)的峰面積；
    V——樣品提取物溶液體積，單位為毫升(mL)；
　　As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中孔雀石綠(無(wú)色孔雀石綠)的峰面積；
    m——樣品重量，單位為克(g)。
8.2  方法回收率
    本方法的回收率≥70％。
8.3  方法檢測(cè)限
    本方法檢測(cè)限：孔雀石綠為2μg/kg；無(wú)色孔雀石綠為4μg/kg。
8.4  批間方法變異系數(shù)
    本方法變異系數(shù)≤15％。
8.5  方法的線性范圍
本方法的線性范圍：孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液0.01 μg/mL～0.40 μg/mL；無(wú)色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液0.02μg/mL～0.40μg/mL。