一：吸光光度法
基于物質對不同波長的光波具有選擇性吸收的能力而建立起來的分析方法。
（一） 光線：
光線的波長： 200nm-400nm 紫外線*
400-750nm可見光*
>750nm 紅外線
光具有波粒二相性，波長不同，其能量不同。
（二） 物質的吸收光譜及顏色：
1． 物質的原子吸收光譜和原子發(fā)射光譜：原子的最外層電子可以選擇性吸收特征波長的電磁波成為
激發(fā)態(tài)而產(chǎn)生的光譜稱為原子吸收光譜。激發(fā)態(tài)原子恢復到基態(tài)，則釋放出特征波長的光子，形成原子發(fā)射光譜。不同的溶液其光譜不同，即不同溶液對不同波長的光其吸收能力不同，對某一特定波長的光存在吸收峰。
2． 可見光由赤橙黃綠青蘭紫等能量不同的光線組成，當可見光穿過某一溶液時，由于特定波長的
光被吸收而使溶液呈現(xiàn)相應的顏色。（如CuSO4由于吸收了可見光中的黃光(600nm)而成藍色）不同顏色的溶液對不同波長的光其吸收能力不同。
（三） 光吸收的基本定律（Lambert-Beer 定律）：
一束平行單色光（Io）通過有色的透明溶液時，一部分的光可以透過溶液（It），另一部分被溶液吸收（Ia）,還有一部分被器皿表面反射（Ir）,則：
Io=It+Ia+Ir 。那么，該溶液透光率為: T = It / Io 。
1． Lambert 定律：設有一束平行單色光,通過液層厚度為b 的均勻透明溶液,則溶液對光的吸收能力:
A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k2b
k2 為吸光系數(shù)，為常數(shù)。與入射光波長、溶液性質、濃度和溫度有關；A 為吸光度（又稱光密度
O.D 或消光度E），當入射光波長、吸光溶液的濃度和溫度一定時，A 與b 成正比。
2． Beer 定律：設有一束平行單色光,通過濃度為c 的均勻透明溶液,則溶液對光的吸收能力:
A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k4c
k2 為常數(shù)。由Beer 定律可知：當入射光波長、吸光溶液的厚度和溫度一定時，A 與c 成正比。
3． Lambert-Beer 定律：綜合1.2.得： A=Kbc ,
即：當入射光波長、吸光溶液的性質和溫度一定時，A 與b、c 成正比。
（四） 吸光光度法的基本原理：
1、 不同物質，由于其分子結構和原子組成不同，故對光的吸收光譜不同（如：CuSO4），在測定不同顏
色的物質濃度時要用最大吸收的波長的入射光，這樣測量的靈敏度最高。
2、 同一種物質，若濃度不同，則對同一波長的入射光的吸收能力（吸光度）也不同，且成正比關系。
3、 應此，利用特定波長的單色光（通常用最大吸收波長的入射光）照射不同濃度的某一溶液時，所得的吸光度大小應與溶液濃度呈線性關系，故可利用該線性關系通過計算或查標準曲線來求得未知溶液的濃度。
（五） 吸光光度法特點：
1． 靈敏度高：mg%級、甚至ug%級。
2． 準確度高：誤差2-5%
3． 操作簡便、快速，儀器設備不復雜，價格低廉，故應用廣泛。
二 ：分光光度計的使用：
（一） 分光光度計的基本原理：利用吸光光度法的原理，采用棱鏡或光柵等分光器獲得純度較高的單色光
來測量未知溶液的濃度的方法。
（二） 常用分光光度計：可見光、紫外、紅外分光光度計，
熒光分光光度計，火焰分光光度計等。
（三） 722 型分光光度計的結構（略）
（四） 722 型分光光度計的使用及注意事項
1、 插上插頭，接通電源，打開暗箱蓋，預熱20min。
* 注意：分光光度計在接通電源而不用時，必須打開暗箱蓋，以免光電管老化。
2、 將準備好的試劑倒入比色杯中，用吸水紙擦去比色杯外側水珠，并依次放入比色杯架中。
* 注意：手拿比色杯毛面，試劑倒入杯中滿2/3 即可，不得將比色杯放在儀器上。
3、 調節(jié)所需波長，靈敏度調至“1”，選擇旋鈕至“T”。
4、 調“0”：打開暗箱蓋，用調“0”旋鈕調節(jié)。
5、 調“100%”：蓋上暗箱蓋，用調“100%”旋鈕調節(jié)，讓光線通過“空白管”。
6、 重復調“0”和調“100%”數(shù)次。
* 注意：若調不到“0”和“100%”，可將靈敏度調至“2”或更高，不得用力強行旋轉旋鈕，以免損壞。
7、 將選擇選扭由“T”調至“A”，此時讀數(shù)應由“100”至“0”，若不為“0”，可用“消光零”旋鈕調節(jié)。
8、 拉動拉桿，分別讀取“A 標”和“A 樣”。
9、 取出比色杯，棄去溶液，洗凈晾干，備用。
（五） 計算
1．利用標準管計算測定物含量：
A 樣=K 樣b 樣c 樣
A 標=K 標b 標c 標
因為入射光的波長，溶液性質和溫度以及比色杯的
厚度都一樣，即：K 樣=K 標 b 樣=b 標
所以：A 樣/ A 標= c 樣/ c 標
得：c 樣= c 標×A 樣/ A 標
2． 利用標準曲線進行計算：
3． 偏離Lambert-Beer 定律的原因
1） 由于非但色光引起的偏離。
2） 由于溶液本身原因引起的偏離：
① 由于介質不均勻引起的偏離
② 由于溶液中化學反應引起的偏離
三：實驗：CuSO4 濃度的測定
C 標= 比色波長=650nm
比色結果： A 標= A 樣=
計算：C 樣=C 標*A 樣/A 標