反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，主要是因?yàn)樗m用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來(lái)分離的，含有疏水的機(jī)制也能以同樣的保留方式分離。

    固定相上還有少數(shù)物質(zhì)，如混合相（例如苯基－己基）、末端封閉和非末端封閉種類和極性嵌入相－也存在于這些鍵合硅膠上。還有很多填料用于反相色譜，包括聚合物，聚合物表面涂上硅膠和氧化鋁，無(wú)機(jī)－有機(jī)混合物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。不同種類的固定相有他們自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

    反相色譜柱利用各種流動(dòng)相和添加物可以有很多的應(yīng)用。一些技術(shù)利用添加物可以改變或修飾填料的表面。有時(shí)候這些添加物有可能會(huì)污染鍵合相表面。

硅膠表面因?yàn)橛兄杷I合相而有一些別的化學(xué)性質(zhì)。殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填料中。這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質(zhì)成分，特別是堿性成分。因?yàn)楣柰榇嫉膒Ka值大約是4.5，離子化能在中性pH條件下發(fā)生因此與陽(yáng)離子產(chǎn)生靜電相互作用就有可能發(fā)生。較老的A型硅膠能容納高濃度金屬離子（有時(shí)候100ppm或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或清除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈鍵合相如C2或C4上更讓人煩惱。

    使用者必須清楚他們所用的固定相表面特殊性質(zhì)和可能的分析物－固定相表面的相互作用，這樣當(dāng)他們使用反相方法時(shí)才能考慮到可能的基質(zhì)相互作用。例如，非常疏水的樣品基質(zhì)如玉米油，高芳香物質(zhì)，和蠟?zāi)苷匙」潭ㄏ嘌b填表面并且改變他們的性質(zhì)。含有蛋白質(zhì)物質(zhì)的生物流體也能吸附在裝填表面。盡管分析者想盡最大努力來(lái)保護(hù)HPLC柱子，某些分析物－基質(zhì)污染能使固定相受到有害的影響。

    當(dāng)柱子被污染，它的色譜行為和沒(méi)被污染的柱子會(huì)有些不同。被污染的柱子能產(chǎn)生反壓?jiǎn)栴}。 被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復(fù)原來(lái)的操作條件。這部分的"柱子觀察"將討論可行的方法使柱子回復(fù)原來(lái)的或差不多原來(lái)的狀態(tài)。因?yàn)殒I合硅膠柱子是最受歡迎的，我重點(diǎn)講述這種柱子。最后，我將討論別的反相柱子的清潔步驟。

    什么導(dǎo)致反相柱子污染產(chǎn)生？通常，樣品中含有一些對(duì)分析者來(lái)說(shuō)不感興趣的東西。鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)是一些可能在使用時(shí)與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)。這些物質(zhì)有比分析者的目標(biāo)物或少或大的保留值。那些保留值較小的物質(zhì)如鹽類一般來(lái)說(shuō)在空體積時(shí)就被沖出色譜柱。這些非目標(biāo)產(chǎn)物的干擾能被檢測(cè)器檢測(cè)到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負(fù)峰。如果樣品成分在柱子中有很強(qiáng)的保留而且流動(dòng)相溶液成分不足以把這些物質(zhì)洗脫下來(lái)，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質(zhì)通常就會(huì)積累在柱頭。這些行為通常只有通過(guò)平行實(shí)驗(yàn)才能發(fā)現(xiàn)。有著中等保留值的樣品能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為寬峰，基線擾動(dòng)，或者基線漂移。

    有時(shí)候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開(kāi)始形成新的固定相。分析物能與這些雜質(zhì)作用形成一定的分離機(jī)理。保留時(shí)間會(huì)波動(dòng)，拖尾會(huì)出現(xiàn)。如果足夠的污染產(chǎn)生，柱子的反壓能超過(guò)泵所能承受的最大壓力，使柱子無(wú)法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。

     清洗硅膠鍵合柱子

     再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)去除。如果污染是因?yàn)橹貜?fù)進(jìn)樣時(shí)強(qiáng)保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡(jiǎn)單的步驟來(lái)除去這些污染物往往能恢復(fù)其色譜行為。有時(shí)候，經(jīng)過(guò)多次操作以后的色譜柱用90～100％的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中較強(qiáng)的溶劑）沖洗20個(gè)體積可以清除污染物。（表2列舉了不同規(guī)格的HPLC柱子的空體積，因此讀者能方便地確定相應(yīng)柱子沖洗的體積。）例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強(qiáng)溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī)溶劑可能會(huì)使HPLC流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀，這樣會(huì)導(dǎo)致更大的問(wèn)題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無(wú)緩沖流動(dòng)相（即把緩沖液換成水）。沖洗5～10個(gè)體積以后才更換強(qiáng)溶劑。

    有時(shí)候，強(qiáng)溶劑也沒(méi)法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強(qiáng)的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來(lái)清洗柱子樂(lè)，如果污染物是非生物物質(zhì)，使用者可以跳過(guò)一個(gè)或多個(gè)另外的有機(jī)溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠家的網(wǎng)頁(yè)上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。

    一般來(lái)說(shuō)，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強(qiáng)度增加，經(jīng)常最后一個(gè)溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來(lái)溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類。我們必須保證一系列溶劑中每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)溶劑互混。清洗過(guò)程要結(jié)束時(shí)，必須借助一個(gè)中等強(qiáng)度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個(gè)非常好的作為中間步驟的溶劑，因?yàn)樗芘c正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過(guò)高。當(dāng)然，如果使用紫外檢測(cè)器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。

    對(duì)于典型的硅膠鍵合柱來(lái)說(shuō)如果沒(méi)有緩沖溶液的話推薦使用以下溶劑系列：

    100％甲醇

    100％乙晴

    75％乙晴－25％異丙醇

    100％異丙醇

    100％二氯甲烷

    100％正己烷

    用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來(lái)的水相溶劑。每種溶劑至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積。如250mm×4.6mmHPLC分析柱，分析者可以用1～2ml/min的流速來(lái)沖洗，要回復(fù)原來(lái)的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過(guò)中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒(méi)有緩沖的流動(dòng)相，最后回復(fù)起始流動(dòng)相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡迎的去除污染的溶劑。如果使用者懷疑柱子被嚴(yán)重污染，可以二甲基亞砜（DMSO）或者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過(guò)色譜柱。成功再生反相柱子是一個(gè)非常耗時(shí)間的過(guò)程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過(guò)夜操作。

    問(wèn)：用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在?如何解決?

    答：關(guān)于漂移問(wèn)題：

    1、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定

    2、流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等

    3、柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的平衡

    關(guān)于快速變化問(wèn)題

    1、流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定

    2、泵中有氣泡，可通過(guò)排氣等操作將氣泡趕出。

    3、流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合

問(wèn)：液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么?

    答：1、篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。

    2、存在干擾峰，解決辦法為使用較長(zhǎng)的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子

    問(wèn)：HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

    答：

    1、樣品量不足：解決辦法為增加樣品量

    2、樣品未從柱子中流出：可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子

    3、樣品與檢測(cè)器不匹配：根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器

    4、檢測(cè)器衰減太多：調(diào)整衰減即可。

    5、檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大：解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)

    6、檢測(cè)器池窗污染：解決辦法為清洗池窗。

    7、檢測(cè)池中有氣泡：解決辦法為排氣。

    8、記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)：調(diào)整電壓范圍即可。

    9、流動(dòng)相流量不合適：調(diào)整流速即可。

    10、檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線：解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。

    問(wèn)：做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在?如何解決?

    答：原因可能有：

    1、泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理；

    2、比例閥失效，更換比例閥即可。

    3、泵密封墊損壞，更換密封墊即可。

    4、溶劑中的氣泡，解決的辦法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法；

    5、系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可。

    6、梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。

    問(wèn)：我最近更換了另一種牌號(hào)的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么?

    答：這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺浣〉哪芰Α１M管過(guò)去幾年來(lái)，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號(hào)的ODS柱上的相對(duì)保留時(shí)間就可能不同。在流動(dòng)相中加入少量競(jìng)爭(zhēng)物，如三乙基胺(TEA)，將會(huì)使硅醇基的成鍵能力飽和，從而保證不同牌號(hào)柱子上的相對(duì)保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性。

    問(wèn)：我購(gòu)買的HPLC柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過(guò)高，請(qǐng)問(wèn)為什么?

    答：柱壓過(guò)高是HPLC柱用戶最常碰到的問(wèn)題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問(wèn)題，您可按下面步驟檢查問(wèn)題的起因。

    1、拆去保護(hù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問(wèn)題，若柱壓仍高，再檢查；

    2、把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查。

    3、將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，(此時(shí)不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)性)。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；

    4、更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說(shuō)明你的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過(guò)濾器便可避免柱壓過(guò)高的問(wèn)題，SGE提供的Rheodyne 7315型過(guò)濾器就是解決這一問(wèn)題的最佳選擇。