一、目的與要求：
1、明確測(cè)定各類色素的原理與方法。
2、通過(guò)此實(shí)驗(yàn)掌握紙層析定性法與提純色素的定量法。
二、原理：
聚酰胺是具有二極性的化合物，水溶性酸性染料在酸性條件下被聚酰胺吸附，而在堿性條件下解吸附，再用紙色譜法或薄層色譜法進(jìn)行分離后與標(biāo)準(zhǔn)比較定性、定量。
三、試劑：
1、聚酰胺粉(尼龍6)
2、硫酸1：1 0
3、甲醇—甲酸溶液：6：4
4、甲醇
5、20％檸檬酸溶液
6、10％鎢酸鈉溶液
7、石油醚：沸程60-90℃
8、海砂：先用l：10鹽酸煮沸15min，用水洗中性，再用5％氫氧化鈉溶液煮沸15min，再于105℃干燥，貯于具玻璃塞的瓶中，備用。
9、乙醇-氨溶液：取1毫升氨水，加70％乙醇至100毫升。
10、50％ 乙醇溶液
11、硅膠G。
12、PH6的水：用20％檸檬酸調(diào)節(jié)至PH 6。
13、鹽酸: 1：10
14、5％氫氧鈉溶液
15、碎瓷片：處理方法同海砂
16、展開(kāi)劑
a、正丁醇-無(wú)水乙醇-1％氨水(6：2：3)：供紙色譜用。
b、正丁醇-吡啶-1％氨水(6：3：4)：供紙色譜用。
c、甲乙酮-丙酮-水(7：3：3)：供紙色譜用。
d、甲醇-乙二胺-氨水(10：3：2)：供薄層色譜用。
e、甲醇-氨水-乙醇(5：1：10)：供薄層色譜用。
f、2.5％檸檬酸鈉-氨水-乙醇(8：1：2)供薄層色譜用。
17、色素標(biāo)準(zhǔn)溶液{以下商品作為標(biāo)準(zhǔn)以100％計(jì)。
胭脂紅：純度60％；莧菜紅：純度60％；檸檬黃：純度60%；靛藍(lán)：純度40％；日落黃：純度60％，亮藍(lán)；純度60％。
精密稱取上述色素各0.100克，用PH6的水溶解，移入100毫升容量瓶中并稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于1毫克商品色素。靛藍(lán)溶液需在暗處保存。
18、色素標(biāo)準(zhǔn)使用液：用時(shí)吸取色素標(biāo)準(zhǔn)溶液各5.0毫升，分別置于50毫升容量瓶中，加PH6的水稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于0.1毫克商品色素。
四、儀器：
1、分光光度計(jì)
2、微量注射器或色素吸管
3、展開(kāi)槽，25 X 6 x 4cm
4、層析缸
5、濾紙、中速濾紙，紙色譜用
6、薄層板：5 X 20em
7、電吹風(fēng)機(jī)
8、水泵
五、操作方法：
1、樣品處理
A、果味水、果子露、汽水：吸取50.0毫升樣品于100毫升燒杯中，汽水需加熱驅(qū)除二氧化碳。
B、配制酒：吸取100.0毫升樣品于燒杯中，加碎瓷片數(shù)塊，加熱驅(qū)除乙醇。
C、硬糖：蜜餞類，淀粉軟糖：稱取5.0或10.0克粉碎的樣品，加30毫升水，溫?zé)崛芙?，若樣液PH值較高，用20％檸檬酸溶液調(diào)至PH4左右。
D、含蛋奶的樣品
(1)奶糖：稱取10.0克粉碎均勻的樣品，加30毫升乙醇-氨溶液溶解，置水浴上濃縮至約20毫升，立即用1：10硫酸調(diào)溶液至微酸隆再加1.0毫升1：l0硫酸，加1毫升l0％鎢酸鈉溶液，使蛋白質(zhì)沉淀，過(guò)濾，用少量水洗滌，收集濾液。
(2)蛋糕類：稱取10.0克粉碎均勻的樣品，加海砂少許，混勻、用熱風(fēng)風(fēng)干樣品(用手摸已干燥即可以)，加入30毫升石油醚攪拌，放置片刻，傾出石油醚，如此重復(fù)處理三次，以除去脂肪吹干后研細(xì)，全部轉(zhuǎn)人G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇—氨溶液提取色素，直至色素全部提完以下按(1)自“置水浴下濃縮至約20毫升”起依法操作。
2、吸附分離
將處理后所得的溶液加熱至70℃，加入0.5-1.0克聚酰胺粉充分?jǐn)嚢?，?0％檸檬酸溶液調(diào)PH至4，使色素完全被吸附，若溶液還有顏色，可以再加一些聚酰胺粉。將吸附色素的聚酰胺全部轉(zhuǎn)入G3垂融漏斗或玻璃漏斗中過(guò)濾(如用G3垂融漏斗過(guò)濾，可以用水泵慢慢地抽濾)。用20％檸檬酸酸化PH＝4的70℃水反復(fù)洗滌，每次20毫升，邊洗邊攪拌，若含有天然色素再用甲醇-甲酸溶液洗滌1-3次，每次20毫升，至洗液無(wú)色為止。再用70℃水多次洗滌至流出的溶液為中性。洗滌過(guò)程中必須充分?jǐn)嚢?。然后用乙?氨溶液分次解吸全部色素，收集全部解吸液，于水浴上驅(qū)氨。如果為單色，則用水準(zhǔn)確稀釋至50毫升，用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。如果為多種色素混合液，則進(jìn)行紙色譜或薄層色譜法分離后測(cè)定，即將上述溶液置水浴上濃縮至約2毫升后移人5毫升容量瓶中，用50％乙醇洗滌容器，洗液并入容量瓶中并稀釋至刻度。
3、定性
A、紙色譜
取色譜用紙，在距底邊2cm的起始線上分別點(diǎn)3-10微升樣品溶液，1-2微升色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，掛于分別盛有a、b、c、d、e、f的展開(kāi)劑的層析缸中，用上行法展開(kāi)，待溶劑前沿展至15cm處，將濾紙取出于空氣中晾干，與標(biāo)準(zhǔn)斑比較定性。
也可取0.5毫升樣液，在起始線上從左到右點(diǎn)成條狀，紙的右邊點(diǎn)色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，依法展開(kāi)，晾干后先定性后定量，靛藍(lán)在堿性條件下易褪色可用e展開(kāi)劑。
B、薄層色譜
(1)薄層板的制備
稱取1.6克聚胺粉，0.4克可溶性淀粉及2克硅膠G，置于合適的研缽中，加15毫升水研勻后，立即置涂布器中鋪成厚度為0.3mm的板。在室溫晾干后，于80℃干燥1小時(shí)置于燥器中備用。
(2)點(diǎn)樣
離板底邊2cm處將0.5毫升樣液從左到右點(diǎn)成與底邊平行的條狀的右邊點(diǎn)2微升色素標(biāo)準(zhǔn)溶液。
(3)展開(kāi)
莧菜紅與胭脂紅用d展開(kāi)劑，靛藍(lán)與亮藍(lán)用e展開(kāi)劑，檸檬黃與其他色素用f展開(kāi)劑。取適量展開(kāi)劑倒入展開(kāi)槽中，將薄層板放入展開(kāi)，待色素明顯分開(kāi)后取出，晾干，與標(biāo)準(zhǔn)斑比較，如比移值相同即為同一色素。
4、定量
A樣品測(cè)定
將紙色譜的條狀色斑剪下，用少量熱水洗滌數(shù)次，洗液移入10毫升比色管中，并加水稀釋至刻度，作比色法定用。
將薄層色譜的條狀色斑包括有擴(kuò)散的部分，分別用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸色素，少量反復(fù)多次至解吸液無(wú)色，收集解吸液于蒸發(fā)皿中，于水浴上揮發(fā)除去氨，移入10毫升比色管中，加水至刻度作比色用。
B、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
分別吸取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml胭脂紅，檸檬黃，日落黃色素標(biāo)準(zhǔn)使用液或0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml亮藍(lán)，靛藍(lán)色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于10ml比色管中，各加水稀釋至刻度。
上述樣品與標(biāo)準(zhǔn)管分別用1cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于一定波長(zhǎng)下（胭脂紅510nm，莧菜紅520nm，檸檬黃430nm，日落黃482nm，亮藍(lán)627nm），測(cè)定吸光度，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線比較或與標(biāo)準(zhǔn)色列目測(cè)比較。
計(jì)算：
X=(A*100)/(m*V2/V1*1000)
式中：
X：樣品中色素的含量，克/千克/升
A：測(cè)定用樣液中色素的含量，毫克
:m：樣品質(zhì)量（體積），克（毫克）
V1：樣品解吸后總體積，毫升
V1：樣液點(diǎn)板（紙）體積，毫升