一、氨基酸自動分析儀法
1.原理
食物蛋白質經鹽酸水解成為游離氨基酸，經氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產生顏色反應，再通過分光光度計比色測定氨基酸含量。一份水解液可同時測定天冬，蘇，絲，谷，脯，甘，丙，纈，蛋，異亮，亮，酪，苯丙，組，賴和精氨酸等16種氨基酸，其最低檢出限為10pmol。
2.適用范圍
GB/T14965-1994食物中氨基酸的測定方法。
本法適用于食物中的16種氨基酸的測定。其最低檢出限為10pmol。本方法不適用于蛋白質含量低的水果、蔬菜、飲料和淀粉類食物的測定
3.儀器和設備
3.1真空泵
3.2恒溫干燥箱
3.3水解管：耐壓螺蓋玻璃管或硬質玻璃管，體積20～30ml。用去離子水沖洗干凈并烘干。
3.4真空干燥器（溫度可調節(jié)）
3.5氨基酸自動分析儀。
4.試劑
全部試劑除注明外均為分析純，實驗用水為去離子水。
4.1濃鹽酸：優(yōu)級純
4.26mol/L鹽酸：濃鹽酸與水1：1混合而成。
4.3苯酚：需重蒸餾。
4.4混合氨基酸標準液（儀器制造公司出售）：0.0025mol/L
4.5緩沖液：
4.5.1pH2.2的檸檬酸鈉緩沖液：稱取19.6g檸檬酸鈉（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至2.2
4.5.2pH3.3的檸檬酸鈉緩沖液：稱取19.6g檸檬酸鈉和12ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調節(jié)至pH至3.3。
4.5.3pH4.0的檸檬酸鈉緩沖液：稱取19.6g檸檬酸鈉和9ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至4.0。
4.5.4pH6.4的檸檬酸鈉緩沖液：稱取19.6g檸檬酸鈉和46.8g氯化鈉（優(yōu)級純）加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至6.4。
4.6茚三酮溶液
4.6.1pH5.2的乙酸鋰溶液：稱取氫氧化鋰（LiOH.H2O）168g，加入冰乙酸（優(yōu)級純）279ml，加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉調節(jié)pH至5.2。
4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亞砜（C2H6OS）和乙酸鋰溶液（2.6.1）50ml加入4g水合茚三酮（C9H4O3.H2O）和0.12g還原茚三酮（C18H10O6.2H2O）攪拌至完全溶解。
4.7高純氮氣：純度99.99%。
4.8 冷凍劑：市售食鹽與冰按1：3混合
5.操作步驟
5.1樣品處理：樣品采集后用勻漿機打成勻漿（或者將樣品盡量粉碎）于低溫冰箱中冷凍保存，分析用時將其解凍后使用。
5.2稱樣：準確稱取一定量樣品，精確到0.0001g。均勻性好的樣品如奶粉等，使樣品蛋白質含量在10～20mg范圍內；均勻性差的樣品如鮮肉等，為減少誤差可適當增大稱樣量，測定前再稀釋。將稱好的樣品防于水解管中。
5.3水解：在水解管內加6mol/L鹽酸10～15ml（視樣品蛋白質含量而定），含水量高的樣品（如牛奶）可加入等體積的濃鹽酸，加入新蒸餾的苯酚3～4滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5min，再接到真空泵的抽氣管上，抽真空（接近0psi），然后充入高純氮氣；再抽真空充氮氣，重復三次后，在充氮氣狀態(tài)下封口或擰緊螺絲蓋將已封口的水解管放在110±1℃的恒溫干燥箱內，水解22h后，取出冷卻。
打開水解管，將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉移到50ml容量瓶內，用去離子水定容。吸取濾液1ml于5ml容量瓶內，用真空干燥器在40～50℃干燥，殘留物用1～2ml水溶解，再干燥，反復進行兩次，最后蒸干，用1mlpH2.2的緩沖液溶解，供儀器測定用。
5.4測定：準確吸取0.200ml混合氨基酸標準，用pH2.2的緩沖液稀釋到5ml，此標準稀釋濃度為5.00nmol/50μL，作為上機測定用的氨基酸標準，用氨基酸自動分析儀以外標法測定樣品測定液的氨基酸含量。
6.計算
上機樣品液（50mL）中氨基酸量（nmol）=
上機標準液（50mL）中氨基酸量（nmol）×樣品峰面積
氨基酸標準峰面積
所以，100g樣品中氨基酸的mg 數(shù)=
上機樣品液中氨基酸量（nmol）×f ×Mr×100
m×V×106
式中
f--樣品的稀釋倍數(shù)
Mr--氨基酸的相對分子量
m--樣品質量（g）
V--上機時的進樣量（此處為50mL）
7.其他
7.1測定條件（以Beckman-6300型氨基酸自動分析儀為例）
緩沖液流量：20mL/h；
茚三酮流量：10mL/h；
柱溫：50、60和70℃；
色譜柱：20cm；
分析時間：42min。
7.2標準出峰順序和保留時間
序號 出峰順序 保留時間/min 序號 出峰順序 保留時間/min
1 天冬氨酸 5.55 9 蛋氨酸 19.63
2 蘇氨酸 6.60 10 異亮氨酸 21.24
3 絲氨酸 7.09 11 亮氨酸 22.06
4 谷氨酸 8.72 12 酪氨酸 24.52
5 脯氨酸 9.63 13 苯丙氨酸 25.76
6 甘氨酸 12.24 14 組氨酸 30.41
7 丙氨酸 13.10 15 賴氨酸 32.57
8 纈氨茇 16.65 16 精氨酸 40.75

7.3允許差： 同實驗室平行測定或連續(xù)兩次測定結果相對偏差絕對值≤12%。

二、食物中胱氨酸的測定方法---氨基酸自動分析儀法（過甲酸氧化）
1.原理
在用鹽酸水解蛋白質的過程中，胱氨酸易被破壞，現(xiàn)多采用過甲酸氧化法將蛋白質中的胱氨酸及半胱氨酸氧化成半胱磺酸，其反應如下：
SH NH2 O SO3H NH2 O
CH2 CH COOH+3H C OOH CH2 CH COOH+3H C OH
半胱氨酸 過甲酸 半胱磺酸 甲酸

生成的半胱磺酸可在氨基酸自動分析儀上進行測定，與標準半胱磺酸比較，計算其含量。
2.適用范圍
參照中國預防醫(yī)學科學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所編寫的食物營養(yǎng)成分測定法第三版。適用于食物中胱氨酸的測定。
3.儀器
水解瓶：耐壓螺蓋玻璃管或硬質試管，體積20～30mL，用去離子水沖凈并烘干，電熱減壓蒸發(fā)器。
4.試劑
過甲酸：取9mL分析純甲酸加入1mL30%過氧化氫混合，在室溫放置2小時以上。
5.操作步驟
5.1過甲酸氧化：稱取一定量的食物樣品置于水解瓶中，使樣品含蛋白質在5～10mg，加入1mL過甲酸試劑，在室溫放置3小時。加1mL乙醇終止氧化。將樣品瓶置于電熱減壓器中，于45℃減壓蒸干，用1mL去離子水淋洗瓶壁，再蒸干，反復3次，以除去過甲酸。
5.2鹽酸水解：同食物中氨基酸（16種）測定方法
5.3在Bekman6300氨基酸自動分析儀上，在注文50℃時用pH3.25檸檬酸緩沖液洗脫，半胱磺酸的出峰時間約在1.78分鐘。
6.計算
上機樣品液（50μl）中半胱磺酸量=
上機標準液中半胱磺酸量（nmol）×樣品峰面積
半胱磺酸標準峰面積

100g樣品中胱氨酸mg數(shù)=
上機樣品中半胱磺酸量（nmol）×D×M×100
W×E×106×2
式中
D：樣品稀釋倍數(shù)
M：胱氨酸分子量（ng）
W：稱樣量（g）
E：上機時的進樣量（此處為50μl）

三、食物中色氨酸的測定--熒光分光光度法
1.原理
食物中蛋白質在酸水解過程中，其色氨酸極易被分解，本法用堿水解蛋白質，直接測定色氨酸的天然熒光。在蛋白質水解液中，只有色氨酸和酪氨酸可以檢測到熒光。在pH為11時，色氨酸的熒光強度比酪氨酸大100倍，且兩種氨基酸的熒光峰相差40多nm，利用此特點，可在有大量酪氨酸的存在下，檢測色氨酸的含量。
2.適用范圍
參照中國預防醫(yī)學科學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所編寫的食物營養(yǎng)成分測定法第三版。適用于食物中色氨酸的測定。
3.儀器
3.1熒光分光光度計
3.2減壓蒸發(fā)器
3.3螺旋蓋大口瓶（瓶蓋要有橡皮墊）
3.4聚四氟乙烯管
3.5小玻璃球
3.6烘箱
4.試劑
（1）5mol/L NaOH：內含0.5%可溶性淀粉，臨用前配制。
（2）4mol/L 尿素（pH=11）
（3） 6mol/L鹽酸
（4） 溴百里酚藍指示劑：稱取0.1g溴百里酚藍加0.1mol/L氫氧化鈉1.6ml，配成0.05%水溶液。
（5） 高純氮（含量99.999%）
（6） 辛醇甲苯溶液：內含1%辛醇
（7） 色氨酸標準液：（1mg/ml）：稱取色氨酸標準，用0.005mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，貯存于冰箱保存。
5.操作步驟
5.1稱取含粗蛋白質約5mg的食物樣品，置于聚四氟乙烯管中，加含可溶性淀粉的5mol/L氫氧化鈉1ml，加入1滴辛醇。
5.2將各管分別蓋上小玻璃球，放入1只帶螺旋蓋的大口玻璃瓶中，將瓶置于減壓蒸發(fā)裝置中，加冰和鹽降溫，減壓至真空度1.3Kpa10mmHg以下，繼續(xù)保持15min，充氮氣再減壓，如此反復3次，迅速旋緊大口瓶的螺旋蓋。
5.3將充氮氣的大口瓶置于烤箱內，在110℃水解樣品22小時。
5.4冷卻大口瓶，用重蒸餾水將樣品分別洗至25ml容量瓶中，（內含6N Hcl0.7ml）用溴百里酚藍為指示劑調pH至中性，用重蒸水定容至刻度。
5.5吸取樣品液1ml，于10ml帶蓋試管內，用pH11的4mol/L尿素溶液稀釋至刻度，在激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長為360mm下測定熒光強度，根據(jù)標準色氨酸的熒光強度曲線，計算樣品中色氨酸含量。
5.6色氨酸標準曲線：用前將標準貯備液稀釋成每ml含100，200，300，400μg的色氨酸標準系列。取每種濃度的標準液各1ml（雙份）與樣品管同樣加試劑，同時水解，以色氨酸標準濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標繪制標準曲線。
6.計算
每100g樣品中的色氨酸含量（mg）=
A×D×100
1000×W
式中
A：根據(jù)標準曲線得到的每ml測定液中色氨酸的含量（mg）
D： 稀釋倍數(shù)
W： 取樣量（克）