維生素D的液相測定方法

1. 原理
樣品中脂溶性維生素在皂化過程中與脂肪分離，以石油醚萃取后，用正相色譜柱提取富集，用反相色譜柱，紫外檢測器定量測定。
2. 適用范圍
本方法來源于GB/T 5413.9-1997。適用于嬰幼兒配方食品和乳粉維生素A、維生素D、維生素E的測定；也適用于食品或強(qiáng)經(jīng)食品及飼料中的維生素D含量的測定。
3. 主要儀器
1) 高壓液相色譜儀，具有可變波長的紫外檢測器，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或記錄儀。
2) 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。
3) 平底燒瓶：250mL。
4) 分液漏斗：500mL。
4. 試劑
所有試劑，如未注明規(guī)格，均指分析純，所實(shí)驗(yàn)用水均指蒸餾水。
1) 異丙醇：色譜純。
2) 2％焦性沒食子酸乙醇溶液：取2g焦性沒食子酸溶液于100mL無水乙醇中。
3) 75％氫氧化鉀溶液：取75g氫氧化鉀溶于100mL水中。
4) 石油醚：沸程30～60℃。
5) 甲醇：色譜純。
6) 正己烷：色譜純。
7) 環(huán)己烷:色譜醇。
8) 維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液
A. 維生素D2標(biāo)準(zhǔn)貯備液：含維生素D2100mg/ml的甲醇溶液。稱取10mg的維生素D2，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
B. 維生素D3的標(biāo)準(zhǔn)貯備液：含維生素D3100mg/ml的甲醇溶液。稱取10mg的維生素D3，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
5. 操作步驟
5.1樣品處理：準(zhǔn)確稱取10g樣品，于250mL平底燒瓶中，加30mL蒸餾水。
5.2測定液的制備：
1) 于上述樣品溶液中加入100mL的20％沒食子酸乙醇溶液，充分混勻后加50mL75％氫氧化鉀溶液，在蒸汽浴上邊續(xù)回流30min后，立刻冷卻到室溫。
2) 將皂化液轉(zhuǎn)入一500mL分液漏斗中，用100mL水分幾次沖平底燒瓶。洗滌液并入分液漏斗中。
3) 于上述分液漏斗中，加入100mL石油醚，蓋好瓶塞，倒置分液漏斗并劇烈振搖1min.在振搖過程中，注意釋放瓶內(nèi)壓力。靜置分層，將水相放入另一500mL分液漏斗中，重復(fù)上棕萃取過程2次，合并醚液到第一個(gè)分液漏斗中。用蒸餾水洗該醚液至中性，通過無水硫酸鈉過濾干燥，在40℃和氮?dú)饬飨拢谛D(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸至近于（絕不允許蒸干）后，用石油醚轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，定容。
4) 從上述容量瓶中取7mL放入一試管中，用氮?dú)鈱⑹兔汛蹈?，于試管中?mL正己烷。
5.3測定：
1) 測定液的制備：
A) 儀器條件：
色譜柱：30cm×40cm，硅膠柱。
流動(dòng)相：正己烷與環(huán)己烷按體積比1：1混合，并按體積分?jǐn)?shù)0.8％加入異丙醇。
流速：1mL/min。
波長：265nm。
柱溫：20℃。
靈敏度：0.005AU/MV。
注射體積：200mL。
B) 注射50mL維生素D標(biāo)樣和200mL樣品溶液，根據(jù)維生素D標(biāo)樣保留時(shí)間收集維生素D于試管中，將試管用氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入0.2mL甲醇溶解。
2) 測定步驟：
A) 儀器條件：
色譜柱：4.6mm×25cm，C18或具同等性能的色譜柱。
流動(dòng)相：甲醇。
流速：1mL/min。
波長：265nm。
柱溫：20℃。
靈敏度：0.005AU/MV。
注射體積：50mL。
B) 注射50mL維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液，注射50mL樣品溶液，得到標(biāo)樣和樣品溶液中維生素D峰面積或峰高。
6. 計(jì)算
ρs×10∕7×40×100
X =
m

As
ρs= ---×ρsd
Asd

式中：X--樣品維生素D的量，mg/100g；
m--稱樣量，含量，IU∕100g；
ρs --進(jìn)樣液中維生素D有濃度，mg/mL；
A s --進(jìn)樣液中維生素D有峰高（或峰面積）；
A s d --標(biāo)樣液中維生素D有峰高（或峰面積）；
ρsd --標(biāo)樣中維生素D的濃度；
計(jì)算結(jié)果精確至小數(shù)點(diǎn)后一位。
7. 注意事項(xiàng)
1) 允許誤差及最小檢出量：同一樣品的2次測定值之差不得超過2次測定平均值的10％；最小檢出量為0.1國標(biāo)單位。
2) 試劑焦性沒食子酸容易變性，應(yīng)購習(xí)近期生產(chǎn)的試劑。
3) 如果皂化不完全，可適當(dāng)增加氫氧化鉀的加入量。