硅鎂吸附劑凈化熒光法
1. 原理
核黃素在440~500nm波長(zhǎng)光照射下發(fā)生黃綠色熒光。在稀溶液中其熒光強(qiáng)度與核黃素的濃度成正比。利用硅鎂吸附劑對(duì)核黃素的吸附作用去除樣品中的干擾熒光測(cè)定的雜質(zhì)，然后洗脫核黃素,測(cè)定其熒光強(qiáng)度。試液再加入低亞硫酸鈉（Na2S2O4），將核黃素還原為無熒光的物質(zhì)，再測(cè)定試液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光強(qiáng)度，兩者之差即為食品中核黃素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。
2.方法來源
參照GB12391-1990 本方法適用于食物及飼料中核黃素的測(cè)定。
3. 儀器
1) 高壓消毒鍋
2) 電熱恒溫培養(yǎng)箱
3) 核黃素吸附柱
4) 熒光分光光度計(jì)。
4. 試劑
試驗(yàn)用水為蒸餾水。試劑不加說明者為分析純。
4.1 硅鎂吸附劑：60~100目，sigma 公司產(chǎn)品。
4.2 2.5mol/L無水乙酸鈉溶液。
4.3 10%木瓜蛋白酶：用2.5mol/L乙酸鈉溶液配制。使用時(shí)現(xiàn)配制。
4.4 10%淀粉酶：用2.5mol/L乙酸鈉溶液配制。使用時(shí)現(xiàn)配制。
4.5 0.1 mol/L鹽酸
4.6 1 mol/L氫氧化鈉
4.7 0.1 mol/L氫氧化鈉
4.8 20%(w/v)低亞硫酸鈉溶液：此液用時(shí)現(xiàn)配。
4.9 洗脫液：丙酮+冰醋酸+水（5+2+9）
4.10 0.04%溴甲酚綠指示劑
4.11 3%（v/v）高錳酸鉀溶液：
4.12 3%(v/v)過氧化氫溶液：
4.13 核黃素標(biāo)準(zhǔn)液的配制：（純度>98%sigma公司）。
A) 核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：（25μg/mL）將標(biāo)準(zhǔn)品核黃素粉狀結(jié)晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。經(jīng)過24小時(shí)后，準(zhǔn)確稱取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5mL水。將容量瓶置于溫水中搖動(dòng)，待其溶解，冷卻至室溫，稀釋至2L，移至棕色瓶中，加少許甲苯復(fù)蓋于溶液表面，于冰箱中保存。
B) 核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取2.00mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于50ml棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度。避光，貯于4℃冰箱，可保存一周。此溶液每毫升相當(dāng)于1.00μg核黃素。
5．操作步驟
整個(gè)操作過程需避光進(jìn)行。
5.1 樣品提取
1) 水解：稱取2~10g樣品（約含10~200μg 核黃素）于100ml三角瓶中，50mL0.1mol/L鹽酸，攪拌直到顆粒物分散均勻。用40ml瓷坩堝為蓋扣住瓶口，于121℃高壓水解樣品30min。水解液冷卻后，滴加1mol/L氫氧化鈉，用0.04%溴甲酚綠作外指示劑調(diào)至pH為4.5。
2) 酶解
A) 含有淀粉的水解液：加入3ml10%淀粉酶溶液，于37~40℃保溫約16h。
B) 含高蛋白的水解液：加3ml10%木瓜蛋白酶溶液，于37~40℃約16h。
5.2 過濾：上述酶解液定容至100.0ml，用干濾紙過濾。此提取液在4℃冰箱中可保存一周。
5.3 氧化去雜質(zhì)：視樣品中核黃素的含量取一定體積的樣品提取液及核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液（約含1~10μg核黃素）分別于20ml的帶蓋刻度試管中，加水至15ml。各管加0.5ml冰乙酸，混勻。加3%高錳酸鉀溶液0.5ml，混勻，放置2min，使氧化去雜質(zhì)。滴加3%雙氧水溶液數(shù)滴，直至高錳酸鉀的顏色褪掉。劇烈振搖此管，使多余的氧氣逸出。
5.4 核黃素的吸附和洗脫
A) 核黃素吸附柱：硅鎂吸附劑約1g用濕法裝入柱，占柱長(zhǎng)1/2~2/3（約5cm）為宜（吸附柱下端用一團(tuán)脫脂棉墊上），勿使柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡，調(diào)節(jié)流速約為60滴/min。
B) 過柱與洗脫：將全部氧化后的樣液及標(biāo)準(zhǔn)液通過吸附柱后，用約20ml熱水洗去樣液中的雜質(zhì)。然后用5.00ml洗脫液將樣品中核黃素洗脫并收集于一帶蓋10ml刻度試管中，再用水洗吸附柱，收集洗出之液體并定容至10ml，混勻后待測(cè)熒光。
6 . 測(cè)定
A) 于激發(fā)光波長(zhǎng)440nm，發(fā)射光波長(zhǎng)525nm測(cè)量樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管的熒光值。
B) 待樣品及標(biāo)準(zhǔn)的熒光值測(cè)量后，在各管的剩余液（約5~7ml）中加0.1ml20%低亞硫酸鈉溶液，立即混勻，在20s內(nèi)測(cè)出各管的熒光值，作為各自的空白值。
7. 計(jì)算
（A-B）×S 100
X = × f ×---
（C-D）×m 1000
式中： X--樣品中含核黃素的量，mg/100g；
A --樣品管熒光值；
B --樣品管空白熒光值；
C --標(biāo)準(zhǔn)管熒光值；
D --標(biāo)準(zhǔn)管空白熒光值；
f --稀釋倍數(shù)；
m --樣品的質(zhì)量，g；
S --標(biāo)準(zhǔn)管中的核黃素含量，μg；
100
-- --將樣品中核黃素量由μg/g折算成mg/100g的折算系數(shù)。
1000
注：1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線由0.01μg至20μg間，呈良好的線形關(guān)系，所以每次測(cè)定樣品的同時(shí)，測(cè)定與樣品含量相近的標(biāo)準(zhǔn)即可。
2．氧化去雜質(zhì)，加入高錳酸鉀的量不宜過多，以避免加入雙氧水的量大，產(chǎn)生氣泡，影響核黃素的吸附及洗脫。