微生食物中維生素B12的測定方法
微生物測定法
1.原理
維生素B12對于Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）的正常生長是必需的，在一定生長條件下，Lactobacillusleichmannii的生長與繁殖速度和溶液中維生素B12的含量成一定的線性關系，利用濁度法或光密度法測定細菌生長和繁殖的強度可間接地測定食物樣品中維生素B12的含量。本方法最低檢出限0.001ng。
2.適用范圍
本方法參考"Official Methods of Analysis of theAssociationof official AnalyticalChemists"、"MethodsofVitamin Analysis"以及"Methodsofthe Microbiological Analysis ofSelectedNutrients"。本方法適用于測定食物及飼料中的維生素B12含量。
3.試劑
本試驗所用水均為蒸餾水，所用試劑均需分析純試劑。
3.1 甲苯
3.2 檸檬酸（C6H8O7·3H2O）
3.3 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）
3.4 焦亞硫酸鈉（Na2S2O5）
3.5 抗壞血酸（生化試劑）
3.6 無水葡萄糖
3.7 無水乙酸鈉
3.8 L-胱氨酸（生化試劑）
3.9 D,L-色氨酸（生化試劑）
3.10 10mol/L氫氧化鈉溶液：稱取200g氫氧化鈉溶于適量水中，定容至500ml。
3.11 （1+4） 乙醇溶液：200ml無水乙醇與800ml水充分混勻。
3.12 酸解酪蛋白：稱取50g不含維生素的酪蛋白于500ml燒杯中，加200 ml3mol/L鹽酸，121℃高壓水解6小時。將水解物轉移至蒸發(fā)皿內(nèi)，在沸水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀，如此反復3次，以去除鹽酸。以溴酚藍作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.5。加20g活性炭，振搖，過濾，如果濾液不呈淡黃色或無色，可用活性炭重復處理。濾液加水稀釋至500ml，加少許甲苯于冰箱中保存。（該試劑也可從Difco公司購得，產(chǎn)品號為No.0288-15-6。）
? 酸解的目的是為了消除酪蛋白中的維生素，確保基本培養(yǎng)基中不含待測定的維生素B12，但有時酸水解不一定徹底，所以一定要選用不含維生素的酪蛋白粉（Sigma公司），這樣可較好地確保酸解酪蛋白中不含維生素B12。
3.13 腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液：稱取硫酸腺嘌呤（純度為98%）、鹽酸鳥嘌呤（生化試劑）以及尿嘧啶各0.1g于250ml燒杯中，加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉淀產(chǎn)生，加鹽酸數(shù)滴，再加熱，如此反復，直至冷卻后無沉淀產(chǎn)生為止，以水稀釋至100ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
3.14 維生素溶液Ⅰ：稱取25mg核黃素，25mg鹽酸硫胺素，0.25mg生物素，50mg尼克酸，用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.15 維生素溶液Ⅱ：將50mg對氨基苯甲酸，25mg泛酸鈣，100mg鹽酸吡哆醇，100mg鹽酸吡哆醛，20mg鹽酸吡哆胺，5mg葉酸溶于（1+4）乙醇溶液，并定容至1000ml。
3.16 甲鹽溶液：稱取25gKH2PO4、25gK2HPO4溶于500ml水中，加5滴濃鹽酸。
3.17 乙鹽溶液： 稱取10gMgSO47H2O、0.5gNaCl、0.5gMnSO44H2O，0.5gFeSO47H2O溶于水并定容至500ml，加5滴濃鹽酸。
3.18 黃嘌呤溶液：稱取1.0g黃嘌呤溶于200ml水中，70℃加熱條件下，加入30mlNH4OH（2+3）L-天冬酰胺溶于水中，并定容至100ml。
3.19 吐溫80溶液：將25g吐溫-80溶于乙醇并定容至250ml。
3.20 維生素B12標準溶液（均使用棕色試劑瓶）
（1）3.20.1維生素B12標準儲備溶液（100ng/ ml）：稱取50μg（精度0.01mg天平）維生素B12暗紅色針狀結晶，用（1+4）的乙醇溶液定容至500ml，儲存在2～4℃條件下。
（2）3.20.2維生素B12標準中間液（1ng/ml）：取1ml儲備液用（1+4）的乙醇定容 至100ml.貯存于2～4℃條件下。
（3）3.20.3 維生素B12標準使用液（0.02ng/ ml）：取1ml中間液用水定容至50ml，用時現(xiàn)配。
? 維生素B12見光易分解，因此在配制標準液時要盡量避光，并且一定要使用棕色試劑瓶。
3.21 基本培養(yǎng)基：將下列試劑混合于500ml燒杯中，加水至200ml，以溴甲酚紫作外指 示劑，用10mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH為6.0～6.1，用水稀釋至250ml。
酸解酪蛋白25ml
腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液5ml
天冬胺酰溶液5ml
吐溫-80溶液5ml
甲鹽溶液5ml
乙鹽溶液5ml
維生素溶液Ⅰ5ml
維生素溶液Ⅱ5ml
黃嘌呤溶液5ml
抗壞血酸1.0g
L-胱氨酸0.1g
D,L-色氨酸0.1g
無水葡萄糖10.0g
無水乙酸鈉8.3g
該培養(yǎng)基也可從Difco公司購得，產(chǎn)品號為No.0457-15-1。
? 由于國內(nèi)某些試劑純度不夠，所以自行配制的培養(yǎng)基較渾濁，嚴重影響到最后的濁度測定結果，因此建議最好使用進口培養(yǎng)基。
3.22 瓊脂培養(yǎng)基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g無水葡萄糖，2g無水磷酸二氫鉀，100ml番茄汁，10ml吐溫-80溶液，每500ml液體培養(yǎng)基加5.0~7.5g瓊脂，加熱溶解，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5~6.8，然后定容至1000ml，分裝于試管中，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出后豎直試管，待冷卻至室溫后于冰箱保存。
3.23 生理鹽水：稱取9.0g氯化鈉溶于1000ml水中，。每次使用時分別倒入2～4支試管中，每支約加10ml，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，備用。
3.24 0.4g/L溴甲酚紫指示劑：稱取0.1g溴甲酚紫于小研缽內(nèi)，加1.6ml 0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
4.儀器與設備
4.1 實驗室常用設備
4.2 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.3 壓力蒸汽消毒器
4.4 液體快速混合器
4.5 離心機
4.6 硬質玻璃試管：20mm×150mm
5.菌種與培養(yǎng)液的制備與保存
5.1 儲備菌種的制備：Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）接種于直面瓊脂培養(yǎng)管中，在37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~24小時，取出后放入冰箱中保存。每周至少傳種二次以上。在實驗前一天必須傳種一次。
?Lactobacillusleichmannii （ATCC7830）的生命力不強，每周一定要至少傳代2-3次，否則極易死亡!
5.2 種子培養(yǎng)液的制備：加2ml 0.02ng/ml維生素B12標準工作液和3ml基本培養(yǎng)基于10ml離心管中，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出冷卻后于冰箱中保存。每次制備兩管，備用。
? 加入離心管中的維生素B12標準工作液要適量，過少會阻礙Lactobacillus Leichmanni的生長，過多會使零管中的光密度值增大，影響測定結果的準確性。一般2-3ml即可。
6. 操作步驟
6.1 接種液的配制：使用前一天，將已在瓊脂管中生長16~24小時的L.leichmannii 接種于種子培養(yǎng)液中，在37±0.5℃培養(yǎng)16~24小時，取出后離心10分鐘（3000rpm），棄去上清液，用已滅菌的生理鹽水淋洗2次，再加入3ml滅菌生理鹽水，混勻后，將此液倒入已滅菌的注射器中，立即使用。
6.2 水解液的制備：稱取1.3g無水磷酸二氫鈉、1.2g檸檬酸及0.1g焦亞硫酸鈉（Na2S2O5），溶于水中并定容至100ml，用時現(xiàn)配。
6.3 稱取適量樣品，至于100ml三角瓶中，加70ml水解液，混勻，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出冷卻至室溫，過濾，然后以溴甲酚紫為外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.0~6.1，將水解液移至100ml容量瓶中，定容至刻度。為保證最后樣品測定管中的Na2S2O5的濃度≤0.03mg/ml，因此要做適當?shù)南♂尅?br /> ? 測定管中Na2S2O5的濃度一定要小于0.03mg/ml，過多會抑制L.Leichmannii的生長，因此在稱取樣品時要考慮到后來的稀釋倍數(shù)，避免由于稀釋倍數(shù)過大造成測定管中的維生素B12含量過低，無法檢出。
? 實驗所用的所有試管必須在烤箱中180-200℃條件下干熱滅菌2-3小時。
6.4 樣品試管的制備：每組平行樣品管中分別加入1.0、2.0、3.0、4.0ml樣品水解液，并用水稀釋至5ml，然后再加入5ml基本液體培養(yǎng)基。
6.5 標準系列管的制備：每組試管中分別加入維生素B12標準工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，使每組試管中維生素B12的含量為0.00ng、0.02ng、0.04ng、0.06ng、0.08ng、0.1ng，加水至5ml，再加入5ml基本液體培養(yǎng)基，需做三組標準曲線。
6.6 滅菌：樣品管與標準管均用棉塞塞好，于121℃高壓滅菌10分鐘。
? 滅菌時間不宜過長，否則會破壞基本培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，影響Lactobacillus Leichmannii的生長，最好在5-10分鐘內(nèi)。
6.7 接種與培養(yǎng)：待試管冷至室溫后，每管接一滴種子菌液，于37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~20小時。
? （1）接種前，接種室要在紫外燈下消毒至少30分鐘。（2）在接種時，其中一支標準系列0管可不接種，這樣可觀察此次實驗是否存在污染，并且可消除由于管中液體的顏色造成的誤差。
6.8 測定光密度值：于640nm波長條件下，以標準系列中零管調(diào)節(jié)儀器零點，測定樣品管液體及標準管液體的光密度值。
? 首先以未接種的標準系列0管進行儀器調(diào)零，然后在用接種后的標準系列0管進行二次調(diào)零，之后再測定其他管中液體的光密度值。
7.結果計算
以維生素B12標準系列的不同納克數(shù)為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線。由樣品測定管中的光密度值在曲線上查出相對應的樣品測定管中的維生素B12含量，再按以下公式計算樣品中維生素B12含量：
     c·V·f
X= --------------×100
      m×1000
式中：
X──樣品中維生素B12含量，μg/100g：
c──測定管中的維生素B12含量，ng：
V──樣品水解液的定容體積，ml：
f──樣品液的稀釋倍數(shù)
m──樣品質量，g。
100/1000 ── 單位換算系數(shù)
8.注意事項
（1） 全部實驗操作應注意避免日光直接照射。
（2） 在人體腸道中，大腸桿菌可以合成維生素B12，因此，此實驗極易被污染，在整個實驗中，最重要的是注意清潔問題，確保所用的玻璃器皿、操作環(huán)境要清潔。