食物中泛酸的測定方法
微生物測定法

1.原理
泛酸對于Lactobacillusplantarum（ATCC8014）的正常生長是一種必需的營養(yǎng)素，在一定生長條件下，Lactobacillusplantarum的生長與繁殖速度同樣品中泛酸的含量成一定的線性關(guān)系，通過利用濁度法或光密度法測定細(xì)菌增殖的強(qiáng)度即可間接地檢測出食物樣品中泛酸的含量。本方法最低檢出限為5ng。

2.適用范圍
本方法參考"Official Methods of Analysis of the Association ofofficialAnalytical Chemists"、"Methods of VitaminAnalysis"以及"Methods of theMicrobiological Analysis ofSelectedNutrients"。本方法適用于測定各類食物（包括天然食物及加工食物）及飼料中的泛酸含量。
3.試劑
本試驗(yàn)用水均為蒸餾水，所用試劑均需分析純試劑。
3.1甲苯
3.2 1mol/L鹽酸溶液
3.3 Tris緩沖溶液：將24.2三羥基氨基甲烷溶于150ml水中，用7.5mol/LNaOH調(diào)pH至8.0~8.3，然后定容至200ml，貯存于4℃冰箱中，可保存2周。
3.4 7.5mol/L氫氧化鈉溶液：溶150g氫氧化鈉于水中，定容至500ml。
3.5 2mol/L醋酸：12ml冰醋酸用水定容至1000ml。
3.6 2mol/L醋酸鈉溶液：將16.4g醋酸鈉用水定容至1000ml。
3.7 2mol/L碳酸氫鉀溶液：稱取10.012g碳酸氫鉀溶于水中，然后定容至500ml。
3.82%堿性磷酸酶溶液：稱取2g堿性磷酸酶（Sigma公司No.P-3877）溶于水中，然后定容至100ml。貯存于4℃冰箱中保存。
3.910%鴿子肝臟提取物溶液：將所用容器在配制此試劑前一天放入4℃冰箱中過夜。(1)稱取30g鴿子肝臟丙酮提取物粉末（Sigma公司,No.L-8376）放入冷的研缽中，分兩次加入300 ml 0.2NKHCO3,至0℃的冰浴中研磨均勻直至呈懸濁液；(2)將此懸濁液分別放入8支離心管中，塞緊后充分振搖，冷凍10分鐘，然后3000轉(zhuǎn)離心5分鐘；(3)將上清夜放入500ml預(yù)冷的廣口燒瓶中，加150g活性Dowex1-X8（Bio-RadLaboratories, Inc.,Brussels, Belgium）,放在冰浴中震搖5分鐘；將混合液倒入離心管中，3000轉(zhuǎn)離心5分鐘；(4)再將上清液移入另一個(gè)冷的500ml廣口燒瓶中，冷凍10分鐘；(5)重復(fù)上述(3)、(4)步驟一次；(6)然后分裝于試管中，冷凍條件下保存，用前化凍。
3.10 酸解酪蛋白液：稱取50g不含維生素的酪蛋白于500ml燒杯中，加200ml3mol/L鹽酸，于壓力蒸汽消毒器內(nèi)10.3×104Pa（15lb/in2）壓力下水解6小時(shí)。將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，在沸水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀，如此反復(fù)3次，以去除鹽酸。以溴酚藍(lán)作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.5。加20g活性炭，振搖，過濾，如果濾液不呈淡黃色或無色，可用活性炭重復(fù)處理。濾液加水稀釋至500ml，貯存于試劑瓶中，加少許甲苯于冰箱中保存。
?酸解的目的是為了去除酪蛋白中的維生素，使基本培養(yǎng)基中不含待測定的維生素，但有時(shí)酸水解不一定徹底，所以一定要選用不含維生素的酪蛋白粉，這樣可較好地確保酸解酪蛋白中不含生物素。
3.11 胱氨酸-色氨酸溶液：稱取4g L-胱氨酸和1gL-色氨酸（或2gDL-色氨酸）于800ml水中，加熱至70-80℃，逐滴加入（1+5）的鹽酸，不斷攪拌，直至完全溶解為止。冷至室溫，加水稀釋至1000ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
3.12腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液：稱取硫酸腺嘌呤（純度為98%）、鹽酸鳥嘌呤（生化試劑）以及尿嘧啶各0.1g于250ml燒杯中，加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉淀產(chǎn)生，加鹽酸數(shù)滴，再加熱，如此反復(fù)，直至冷卻后無沉淀產(chǎn)生為止，以水稀釋至100ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
3.13 吐溫80溶液：將25g吐溫溶于乙醇中并定容至250ml。
3.14維生素溶液Ⅰ：稱取20mg核黃素，10mg鹽酸硫胺素，0.04mg生物素，用0.02mol/L醋酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.15維生素溶液Ⅱ：10mg對氨基苯甲酸，50mg尼克酸，40mg鹽酸吡哆醇，溶于（1+3）的乙醇溶液，并定容至1000ml。
3.16 鹽溶液A：稱取25g磷酸二氫鉀和25g磷酸氫二鉀溶于500ml水中，加5滴濃鹽酸。
3.17 鹽溶液B：稱取10g MgSO4 7H2O、1g KCl、0.5g MnSO4 4H2O，0.5g FeSO47H2O、23ml 85% H3PO4，溶于水中并定容至500ml。
3.18 泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液

名稱
 濃度
 配置方法
 
標(biāo)準(zhǔn)

儲(chǔ)備液
 40μg / ml
 稱取43.47mgD-泛酸鈣（Sigma公司，No. P-2250）標(biāo)準(zhǔn)物，溶解于500ml 水中，加入10ml 0.2mol/L的醋酸，100ml 0.2mol/L醋酸鈉，然后用水定容至1000ml，此時(shí)溶液的泛酸鈣濃度為43.47μg / ml，相當(dāng)于泛酸濃度為40μg / ml，貯存于2-4℃冰箱中。
 
標(biāo)準(zhǔn)

中間液
 1.0μg / ml
 取25ml儲(chǔ)備液放入500ml水中，再加入10mlmol/L的醋酸，100ml 0.2mol/L醋酸鈉，然后用水定容至1000ml，在2-4℃冰箱中貯存。
 
標(biāo)準(zhǔn)

工作液
 10 ng / ml
 取1ml中間液用水定容至100ml，在2-4℃冰箱中貯存。
 

3.19基本培養(yǎng)基：將下列試劑混合于500ml燒杯中，加水至200ml，以溴麝香草酚藍(lán)作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH至6.8，用水稀釋至250ml。
酸解酪蛋白 25ml
胱氨酸、色氨酸溶液 25ml
腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液 5ml
維生素溶液Ⅰ 5ml
維生素溶液Ⅱ 5ml
鹽溶液A 5ml
鹽溶液B 5ml
無水葡萄糖 10g
三水醋酸鈉 8.3g
吐溫80溶液 0.25ml
此培養(yǎng)基也可從Difco公司購得，產(chǎn)品號為0816-15-7。
? 由于國內(nèi)的某些試劑純度不夠，所以自行配制的培養(yǎng)基較渾濁，嚴(yán)重影響到最后的濁度測定結(jié)果，因此建議使用進(jìn)口培養(yǎng)基。
3.20瓊脂培養(yǎng)基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g無水葡萄糖，2g無水磷酸二氫鉀，100ml番茄汁，10ml吐溫80，加熱溶解，用40%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5~6.8，然后定容至1000ml，每500ml液體培養(yǎng)基加5.0~7.5g瓊脂，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出后豎直試管，待冷卻至室溫后于冰箱2-4℃條件下保存。
3.21生理鹽水：稱取9.0g氯化鈉溶于1000ml水中，。每次使用時(shí)分別到入2~4支10ml試管中，每支約加10ml，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，備用。
3.22 0.04%溴麝香草酚藍(lán)溶液：稱取0.1g溴麝香草酚藍(lán)于小研缽內(nèi)，加1.6ml0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
3.23 0.04%溴甲酚綠溶液：稱取0.1g溴甲酚綠于小研缽中，加1.4ml0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
3.24 0.1%溴酚藍(lán)乙醇溶液：稱取0.1g溴酚藍(lán)，用乙醇溶解后，加乙醇稀釋至100ml。
3.25 番茄汁：將新鮮番茄去皮、去籽，制成勻漿后，用紗布過濾數(shù)次，直至呈淡黃色透明液體，在液面上加幾滴甲苯，冷凍保存。
4.儀器與設(shè)備
4.1 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備
4.2 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.3 壓力蒸汽消毒器
4.4 液體快速混合器
4.5 離心機(jī)
4.6 722分光光度計(jì)
4.7 硬質(zhì)玻璃試管：20mm×150mm
5.菌種與培養(yǎng)液的制備與保存
5.1 儲(chǔ)備菌種的制備：Lactobacillusplantarum（ATCC8014）接種于直面瓊脂培養(yǎng)管中，在37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~24小時(shí)，取出后放入冰箱中保存，每隔兩周至少傳種一次。在實(shí)驗(yàn)前一天必須傳種一次。
5.2種子培養(yǎng)液的制備：加2ml泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和3ml基本培養(yǎng)基于10ml離心管中，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出，冷卻后于冰箱中保存。每次制備兩管，備用。
?加入離心管中的泛酸標(biāo)準(zhǔn)液要適量，過少會(huì)影響Lactobacillusplantarum的生長，過多則不宜于洗凈殘余泛酸，因此會(huì)使零管中的光密度值增大，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般2-3ml標(biāo)準(zhǔn)工作液即可。
6.操作步驟
6.1接種液的配制：使用前一天，將已在瓊脂管中生長16-24小時(shí)的L.plantarum接種于種子培養(yǎng)液中，在37±0.5℃培養(yǎng)16-24小時(shí)，取出后離心10分鐘（3000rpm），棄取上清液，用已滅菌的生理鹽水淋洗2次，再加入3ml滅菌生理鹽水，混勻后，將此液倒入已滅菌的注射器中，立即使用。
6.2 樣品制備：
稱取適量樣品，放入100ml三角瓶中，加10mlTris緩沖液，加蒸餾水30ml，混勻于121℃高壓條件下水解15分鐘，取出冷卻至室溫，定容至50ml，過濾。
? 泛酸在空氣中穩(wěn)定，但對于熱不穩(wěn)定，因此水解時(shí)間切勿過長。
取1ml樣品液（5.2.1.），加入0.4ml堿性磷酸酶溶液，0.2ml肝臟提取物溶液，0.1ml碳酸氫鈉溶液，0.4ml蒸餾水，混勻后，37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。
加水至20ml，以溴甲酚綠為外指示劑，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH=4.5，定容至25ml，過濾。
取適量水解液（5.2.3）于25ml具塞刻度試管中，以溴麝香草酚藍(lán)為外指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH=6.8，用水定容至某刻度。
樣品試管的制備：于平行樣品管中分別加入1.0、2.0、3.0、4.0ml樣品水解液（5.2.4），加水至5ml，然后再加入5ml基本液體培養(yǎng)基。
6.3標(biāo)準(zhǔn)管的制備
每組試管中分別加入泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml（相當(dāng)0.0、10.0、20.0、 30.0、40.0、50.0ng泛酸），加水至5ml，再加入5 ml基本液體培養(yǎng)基， 需做三組標(biāo)準(zhǔn)曲線。。
6.4滅菌：樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管均用棉塞塞好，于121℃高壓滅菌10分鐘。
?滅菌時(shí)間不宜過長，否則會(huì)破壞基本培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，影響Lactobacillusplantarum的生長，最好在5-10分鐘內(nèi)。
6.5 接種與培養(yǎng)：待試管冷至室溫后，每管接種一滴種子液，于37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~20小時(shí)。
?（1）接種前，接種室要在紫外燈下消毒至少30分鐘。（2）在接種時(shí)，其中一支標(biāo)準(zhǔn)系列0管可不接種，這樣可觀察此次實(shí)驗(yàn)是否存在污染，并且可消除由于管中液體的顏色造成的誤差。
6.6 測定：722分光光度計(jì)，波長640nm條件下，以標(biāo)準(zhǔn)系列0管儀器調(diào)零，測定樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值。
? 首先以未接種的標(biāo)準(zhǔn)系列0管進(jìn)行儀器調(diào)零，然后再用接種后的標(biāo)準(zhǔn)系列0管進(jìn)行二次調(diào)零，之后再測定其他管中液體的光密度值。
7.計(jì)算
以泛酸標(biāo)準(zhǔn)系列的不同納克數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制做標(biāo)準(zhǔn)曲線。在曲線上查出相對應(yīng)的樣品測定管中的泛酸含量，然后再按以下公式計(jì)算樣品中泛酸含量：
    C·V·F
X=-------------- ×100
     m×1000
式中
X ── 樣品中泛酸含量，μg/100g：
C ── 測定管中的泛酸含量，ng：
V ── 樣品水解液的定容體積，ml：
F ── 樣品液的稀釋倍數(shù)
m ── 樣品質(zhì)量，g。
100/1000 ── 單位換算系數(shù)