氧化苦參堿是從豆科槐屬植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)及苦參(Sophora flavescens Ait.)根中提取分離得到的一種雙稠哌啶衍生物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明氧化苦參堿具有抗心率失常、抗炎、抗腫瘤等作用^{［1，2］}。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道氧化苦參堿血藥濃度的測(cè)定方法有離子對(duì)比色法^［3］、毛細(xì)管氣相色譜法^［4］等，本文用高效液相色譜法測(cè)定了人血漿中的氧化苦參堿含量，此方法具有專(zhuān)屬性強(qiáng)、血漿用量少、檢測(cè)靈敏度高、測(cè)定穩(wěn)定性好、快捷方便等特點(diǎn)。
1　儀器與試藥
LC－10A高效液相色譜儀，SPD－10A紫外檢測(cè)器，C－R7Ae色譜數(shù)據(jù)處理器(日本島津)；FZQ－2型旋渦混合器；LN－9527－01型高速離心機(jī)(美國(guó)雅培公司)。
氧化苦參堿對(duì)照品：批號(hào)為0780－9703(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，丙酮重結(jié)晶后使用)。甲醇、己烷為色譜純，其余試劑均為分析純。
氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱(chēng)取氧化苦參堿適量，用水溶解制成濃度為200 mg^.L^-1的溶液，置4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br /> 受試者：4名，年齡22～25歲，體重76～90 kg，均為健康男性。
2　色譜條件
Spherisorb－SiO₂不銹鋼柱(250 mm×4.6 mm)5 μm；流動(dòng)相：甲醇一正己烷(4∶1)，每100 mL加28 %氨水1.2 mL。流速：2.0 mL^.min^-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。
3　血漿樣品處理
精密吸取血漿樣品0.5 mL，置10 mL離心管中，加入0.8 mol^.L^-1高氯酸1.0 mL，混旋振蕩1 min，離心5 min(3000 r^.min^-1)，將上清液全部轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入20 %氫氧化鈉溶液0.35 mL，用氯仿－正丁醇混合液(98∶2) 3 mL混旋振蕩提取2次，每次2 min，離心3 min(3000 r^.min^-1)，合并有機(jī)相，在70 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，將殘留物?zhǔn)確用200 μL甲醇溶解，離心3 min(10000 r^.min^-1)，取20 μL進(jìn)樣分析，血漿色譜圖見(jiàn)圖1。
4　標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
精密吸取健康人空白血漿0.5 mL，共7份，置7支10 mL離心管中，定量加入氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，使其濃度分別為1.2、2.4、4.8、7.2、12.0、24.0、36.0 mg^.L^-1，按“樣品處理方法”項(xiàng)下操作，進(jìn)行色譜分析，以氧化苦參堿峰面積A對(duì)濃度C(mg^.L^-1)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：
A=12912.65C-5426.69　r=0.9999　n=3
當(dāng)S/N=2時(shí)，最低檢出濃度為0.1 mg^.L^-1。

A.      空白血漿　B.氧化苦參堿血漿樣品
1.氧化苦參堿(11.2 min)

 

5   回收率試驗(yàn)
分別于0.5 mL空白血漿中定量加入氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，使其濃度分別為1.2、4.8、12.0、36.0 mg^.L^-1，按“樣品處理方法”項(xiàng)下操作，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算求得的血藥濃度與實(shí)際濃度之比即為本方法的回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

6　精密度試驗(yàn)
分別在“回收率試驗(yàn)”項(xiàng)下4種血藥濃度水平上進(jìn)行日內(nèi)與日間(5 d)精密度考察。

7　穩(wěn)定性試驗(yàn)
　　取正常人空白血漿5 mL，定量加入氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，使其濃度為4.8 mg^.L^-1，分為三組，每組三管，每管0.5 mL。第一組立即處理并測(cè)定；第二組立即處理后殘?jiān)?20 ℃冰箱1周后測(cè)定；第三組血漿樣品置-20 ℃冰箱1周后處理并測(cè)定。結(jié)果表明，第二、第三組相對(duì)第一組的含量分別為98.8 %和102.5 %，表明氧化苦參堿穩(wěn)定性良好。
8　樣品測(cè)定
4位健康志愿者肌肉注射氧化苦參堿注射液300 mg，給藥后的5、10、20、30、40、60、90、120 min定時(shí)靜脈取血2 mL。分離血漿，取0.5 mL按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，測(cè)定氧化苦參堿含量，以給藥時(shí)間為橫坐標(biāo)，血漿中的氧化苦參堿濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制藥時(shí)曲線

9　討論
本文曾采用C₁₈柱及氨基鍵合柱作為分離柱，以甲醇、水、乙腈等作為流動(dòng)相，試圖對(duì)氧化苦參堿血漿樣品進(jìn)行分離，但均未取得成功，最終以硅膠柱為分離柱，甲醇—己烷(4∶1)為流動(dòng)相，獲得了理想的分離及峰形。流動(dòng)相中適當(dāng)加入氨水可以很好地改善氧化苦參堿的峰形?！　⊙趸鄥A極性較大，很難被有機(jī)溶劑提取，在強(qiáng)堿性條件下以游離堿形式存在時(shí)在氯仿中具有較好的溶解性，因此我們采用了氯仿—正丁醇混合液提取法，結(jié)果十分理想。用高氯酸沉淀血清蛋白后，氫氧化鈉溶液的加入量是影響氧化苦參堿提取率的關(guān)鍵因素，實(shí)際測(cè)定中，20 %氫氧化鈉的加入量超過(guò)0.30 mL時(shí)氧化苦參堿的提取率較高。
有人曾用三氯醋酸作為血清樣品提取前的蛋白沉淀劑^［5］。在本實(shí)驗(yàn)條件下采用它，血清峰較復(fù)雜，對(duì)氧化苦參堿的分離有干擾，所以我們用高氯酸作為蛋白沉淀劑，結(jié)果滿意。